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流感病毒鸡胚分离技术

发布时间:2018-5-22 来源:检验科 作者:戴慧    自动滚屏(右键暂停)

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    一、鸡胚的结构和生理
    卵壳:最外层的坚硬壳层
    壳膜:气体和液体分子交换
    气室:呼吸和调节压力
    绒毛尿囊膜:呼吸器官
    羊膜:含羊水,胚胎在其中
    尿囊腔:排泄器官
    卵黄囊:提供营养
    卵白:为胚胎发育晚期提供营养
    二、鸡胚的孵育
    受精鸡卵:来亨鸡,SPF级鸡胚
    孵育温度:最适温度37.8℃
    孵育湿度:40%-70%
    鸡胚摆放:大头朝上,小头朝下,不能平放。
    翻卵:防止卵白与壳膜粘连、促进羊膜运动和空气流通
    通风:排出CO2,吸入O2
    三、检卵与标记
    1、鉴别死胎和未受精的鸡胚
    2、将孵育好的鸡胚圆头朝下,倾斜45°倒扣于检卵灯圆孔上转动鸡胚,观察亮黑点(眼睛)位置并标记,标记气室位置。
    3、在蛋壳上用铅笔标记标本编号。
    4、在鸡蛋顶端与眼睛处连一直线,直线和气室相交处与顶点约1/2处为接种点。
    四、接种
    1、标本处理:样品加入2%的三抗后静置4小时
    三抗含量:一万个单位/毫升 青霉素、 一万个单位/毫升 庆大霉素、一万个微克/毫升 链霉素。
    做PCR测定型别和CT值。选择CT值小于30的样品上样
    2、鸡蛋用酒精消毒后,用打孔器在接种点打一小孔,用装有7号针头的1ml注射器吸取900ul标本后,顺着接种线打到底,注入150ul标本,抽出1/2后,再注入150ul标本,退出。用白蜡封口。
    3、35℃温育2-3天,24h内用照卵灯观察一次,若24h内死亡为非特异性死亡。
    五、收获及鉴定
    鸡胚在收获前应4℃过夜或-20℃放置一小时,标记15ml无菌离心管与相应鸡胚编号一致,酒精消毒鸡胚顶部,用无菌剪刀顺标记位置剪去鸡胚气室蛋壳,推开鸡胚尿囊膜,用10ml吸管吸取鸡胚尿囊液于相应收集管中;左手持无菌镊子,夹住鸡爪上方关节部分,右手持吸管刺破鸡胚羊膜,尽量吸取羊水放置于另外的管中,也可将3个鸡胚的羊水合并,将收获液3000rpm离心5分钟去除血液和细胞,进行红细胞凝集实验。
    六、注意事项
    1、防止污染。为了减少污染的危险,整个过程均需无菌操作,否则鸡胚一经污染,即迅速死亡或影响病毒的培养。
    2、适宜的培养温度。
 


 
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